何中石
随着近年来全球淡水水体有害蓝藻水华事件暴发的日益频繁，蓝藻毒素也正以前所未有的多样性、强度和分布侵袭全球水体。尖头藻是近年来最为成功的入侵蓝藻，其在我国的分布区域从南方热带亚热带湖库迅速扩张到北方温带水体。拟柱孢藻毒素（cylindrospermopsin，CYN）是尖头藻产生的主要蓝藻毒素，其具有独特的多器官毒性。
中国科学院水生生物研究所渔业智能技术与装备学科组的研究人员，以大型溞为实验材料，结合转录组学、动物行为学、物理流体力学分析等多学科手段全面探究了CYN的毒性。研究人员将大型溞分别暴露在实际环境可考的CYN浓度梯度下（0，1.5，2.0，10，100，1000 μg/L），进行了急性与慢性毒性测试、生理与行为测试、转录组分析和细胞关键酶定量等一系列实验。结果表明：CYN在高浓度下可以对大型溞产生急性毒性，48 h内可以达到较高的固定率（致死率）；在低浓度长期暴露下可以产生生殖毒性及发育毒性。有趣的是，在慢性毒性实验中研究人员发现CYN可以强化大型溞的繁殖力（产生子代数量）。研究人员认为天然毒素CYN可以激发大型溞产生跳船理论的特殊应答机制，即大型溞通过牺牲个体发育以换取更高的生殖量；通过确定关键脂质的变化确定了花生四烯酸等参与了该过程，初步揭示了这一理论的分子机制。
动物行为作为综合神经功能的最高水平体现，可以客观展现化学物质的整体毒性效应。研究人员通过对大型溞的运动影像记录数据的分析，总结出12种典型运动模式，并进行了二维分型。发现大型溞在CYN的暴露下更倾向于“静止”；并且在活跃运动状态下“漫步运动”比例减少，“圆圈运动”和“冲撞运动”这类非正常运动模式比例显著增加。此外，新开发的运动参数进一步证明CYN能够显著减弱的大型溞的行为强度和主动行为意愿（图1），表明了CYN对能量代谢和神经功能具有毒性效应。
图1 CYN胁迫下D. magna的整体及细节行为模式的变化
研究人员通过转录组分析和细胞关键酶的定量测定对产生这些毒性效应的分子机制进行了深入研究（图2）。结果表明：CYN可以通过提升细胞活性氧水平（ROS）并且同时降低谷胱甘肽含量（GSH）和重要抗氧化催化物及载体血红素的合成量以产生氧化损伤；通过降低乙酰胆碱脂酶（AChE）及毒蕈碱型乙酰胆碱受体(CHRM）的活性产生神经毒性；通过显著干扰氧化磷酸化过程的中间酶对细胞能量代谢产生毒性；并且通过影响细胞胰蛋白酶的含量影响大型溞的滤食率和滤水率。通过这些复杂的分子毒性机制，CYN对大型溞多个系统产生细胞毒性，并最终导致了多器官毒性效应。
图2 CYN对D. magna的分子致毒机理总览图
本研究全面揭示了拟柱孢藻毒素对大型溞的毒性效应和分子致毒机理，同时发现了大型溞在天然毒素暴露下的特殊应答机制，强调了拟柱孢藻毒素在全球淡水水体的潜在危害性，特别是对浮游动物的影响。相关研究成果以“Combined Methods Elucidate the Multi-organ Toxicity of Cylindrospermopsin (CYN) on Daphnia magna”为题发表于Environmental Pollution，原文链接：https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S026974912300252X。硕士研究生何中石为本论文的第一作者，虞功亮项目研究员为该论文的通讯作者。该研究得到了政府间国际科技创新合作项目（2021YFE0112000）和水生生物研究所特色研究所项目（Y85Z061601）的资助。
致谢：感谢水生所虞功亮项目研究员学科组成员何中石对此文的支持！
分析测试中心基因组学技术平台简介
中国科学院水生生物研究所分析测试中心基因组学技术平台是具有华中地区生命科学研究特色的公共技术支撑平台，聚集基因组学前沿及高端大型科研仪器设备，推动科技资源共享。平台以基因组技术、单细胞测序技术、核酸定量检测分析技术3个专业方向为核心，可以提供各种类型文库的构建、测序、数据分析一体化的技术服务，服务方式高效、快捷、灵活，致力于为水生生物研究所、武汉区域中心、周边高校及企业的科研工作者提供优质、高效的基因组技术服务。
基因组学技术平台主要提供以下技术服务：
一、一代测序
一代测序，也称Sanger测序，是基因测序的金标准。目前平台能够提供常规测序、菌种鉴定、Fosmid/BAC双末端测序、大片段鸟枪法测序、EST测序和分析、步移测序、SnaPshot进行SNP分型及鉴定、引物合成、标记引物合成、全基因合成、TA克隆、载体构建等相关技术服务。
二、 二代测序
1、单细胞测序服务
（1）单细胞转录组测序服务
单细胞转录组学测序能有效解决组织样本无法破解的细胞异质性以及常规RNA-seq被掩盖的细胞群内的转录组异质性难题，能够发现新的稀有细胞类型，探索遗传和功能异质、重建进化谱系、并深入了解发育过程中的表达调控机制。
（2）单细胞基因组测序服务
在单细胞水平对全基因组进行扩增与测序的一项新技术，其原理是将分离的单个细胞的微量全基因组DNA进行扩增，获得高覆盖率的完整的基因组后进行高通量测序用于揭示细胞群体差异和细胞进化关系。
2、转录调控及表观组测序服务
转录组研究是基因功能及结构研究的基础和出发点，能够全面快速地获得某一物种特定组织或器官在某一状态下的几乎所有转录本序列信息。表观遗传是指在基因的DNA序列没有发生改变的情况下，基因功能发生了可遗传的变化，并最终导致表型的变化。平台目前能够提供真核转录组、原核转录组、宏转录组、Small RNA测序及Chip-seq、ATAC-seq等表观组的测序技术服务。
3、扩增子测序服务
扩增子测序是指利用合适的通用引物扩增环境中微生物的16S rDNA/18S rDNA /ITS高变区或功能基因，通过高通量测序技术检测PCR产物的序列变异和丰度信息，分析微生物群落的多样性、分布规律及进化关系等。
平台能够提供16S/18S/ITS/功能基因等扩增子测序服务，服务内容包括DNA提取、建库、测序及分析，可以接收的样本类型为水体样本（滤膜）、土壤样本（淤泥、沉积物）、粪便（肠道）样本或DNA样本。
4、宏基因组测序服务
宏基因组学，又称元基因组学，是以特定环境中的整个微生物群落作为研究对象，无需分离培养，直接提取环境样本DNA，研究环境微生物的群落结构、物种分类、系统进化、基因功能及代谢网络等。平台能够提供各种环境样本的宏基因组测序服务。
三、 三代测序
1、基因组组装技术服务：
在以往基于短片段的基因组拼接中，由于一些动植物基因组本身具有多倍体，高度重复，高度杂合的特性，导致基因组拼接异常艰难。而纳米孔测序技术具有长读长的特点，利于基因组的拼接，可以极大的提高基因组的完整性。
2、直接RNA测序服务：
纳米孔测序是唯一可以直接对RNA链进行测序的技术，不经反转录、无需扩增，无测序偏好性，检测RNA分子甲基化（m6A和m5C等）修饰位点；还可对Poly（A）尾长度进行相对准确地估算，还原真实RNA特征。
3、全长转录组测序服务：
以往的转录组测序往往需要先对mRNA进行打断，再反转录为cDNA，无法获取和分析全长转录本。纳米孔测序的长读长特点可以准确识别各基因的多个同源异构体；识别基因的结构变异和基因融合，鉴定转录调控过程中复杂的转录事件。
4、基因组结构变异分析：
Bionano单分子光学图谱分析系统采用纳米泳道对单分子DNA进行拉伸成像，从而获得高准确性和高分辨率的全基因组结构图谱。该系统所测长度能够轻松跨越重复片段和包括复杂元件的区域，可实现超高灵敏度的结构变异检测，包括：染色体片段微扩增、微缺失，染色体平衡易位，片段易位，倒位、串联重复等。广泛应用于分子育种、比较基因组、进化基因组、基因组结构变异检测、拷贝数变异检测、生殖遗传等研究领域。
四、 核酸定量检测分析
1、核酸SNP分型和甲基化分析
平台配置的核酸质谱分析系统是应用飞行时间质谱技术对复杂生物样品中核酸进行高通量SNP基因型分析和甲基化分析的自动化平台，是目前SNP分型和DNA甲基化检测的金标准。
该系统反应体系不需要杂交，可避免杂交错配干扰，也不需要荧光标记，主要应用于体细胞突变分析、分子辅助育种、种群遗传结构分析、品系鉴定、超高灵敏度突变检测、遗传药理学和遗传病检测、农业基因组学、基因甲基化分析等。
2、核酸绝对定量分析
平台配置的微滴式数字PCR是一项针对单分子目标DNA的绝对定量技术，该技术是将含有DNA模板的反应溶液分配到大量独立的反应室中并且发生扩增反应，通过统计反应室中的阳性信号来定量DNA的拷贝数。
该仪器不需要标准品即可实现靶分子的绝对定量，能够检测含量极低的核酸序列，灵敏度低至单个拷贝核酸分子；同时采用终点检测法，不依赖Ct值，不依赖扩增效率，能够有效克服抑制剂对结果分析的影响，主要应用于稀有突变分析、SNP分析、病原微生物检测、mRNA和microRNA检测、拷贝数变异、精确的基因表达分析、单细胞基因表达分析等。
3、NanoString数字化表达谱分析
该系统应用单分子标签技术实现真正的数字定量和多重靶点高通量分析，不需要PCR扩增，还可以同时对DNA/RNA/蛋白质进行检测。该系统可以快速、准确实现单个样品一次检测800个靶点，主要用于多重基因靶点和蛋白靶点直接杂交检测、基因表达分析、蛋白表达谱分析、miRNA分析、基因拷贝数变异检测等。
基因组技术平台联系方式：
乔志仙 TEL：027-68780783 MAIL：qzhxian@ihb.ac.cn
柴小翠 TEL：027-68780783 MAIL：chaixiaocui@ihb.ac.cn
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